Новости

May 16, 2023

Высокопроизводительный метод измерения размера яиц дрозофилы

Scientific Reports, том 13, номер статьи: 3791 (2023) Цитировать эту статью 689 Доступов 2 Цитирования 4 Подробности альтметрических показателей Черты жизненного цикла используются в качестве показателей приспособленности у насекомых, в том числе

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 3791 (2023) Цитировать эту статью

689 Доступов

2 цитаты

4 Альтметрика

Подробности о метриках

Черты жизненного цикла используются в качестве показателя приспособленности у насекомых, включая дрозофилу. Размер яиц — это адаптивный и экологически важный признак, который потенциально может иметь генетические вариации в разных популяциях. Однако низкая производительность ручного измерения размера яиц препятствовала широкому использованию этого признака в эволюционной биологии и популяционной генетике. Мы разработали метод точного и высокопроизводительного измерения размера яиц дрозофилы с использованием проточной цитометрии крупных частиц (LPFC). Оценки размера с использованием LPFC точны и тесно связаны с измерениями, выполненными вручную. Измерение размера яиц отличается высокой производительностью (в среднем 214 яиц в минуту), а жизнеспособные яйца определенного размера можно быстро отсортировать (в среднем 70 яиц в минуту). Сортировка с помощью LPFC не снижает выживаемость яиц, что делает ее подходящим подходом для сортировки яиц для последующего анализа. Этот протокол может быть применен к любому организму в пределах обнаруживаемого диапазона размеров (10–1500 мкм) проточных цитометров крупных частиц. Мы обсуждаем потенциальные применения этого метода и даем рекомендации по оптимизации протокола для других организмов.

Размер яиц является важной характеристикой насекомых, которые эволюционировали в ответ на давление развития и экологию1. Размер яиц и другие характеристики жизненного цикла (например, выживаемость, долголетие и плодовитость самок) являются показателями приспособленности насекомых. У Drosophila melanogaster размер яиц влияет на другие характеристики жизненного цикла, например, жизнеспособность эмбриона, скорость вылупления и эмбриональное развитие2, а также морфологические особенности, такие как передне-заднее расположение эмбрионального паттерна3,4. Скопление личинок5 и факторы окружающей среды, такие как температура, влияют на размер яиц D. melanogaster6,7,8. Размер яиц D. melanogaster увеличивается с увеличением широты в Австралии и Южной Америке7, что позволяет предположить, что это адаптивный признак в условиях стабилизирующего отбора2. Дрозофила — один из наиболее широко используемых половых многоклеточных организмов в эволюционной биологии. Эта популярность отчасти объясняется коротким временем генерации дрозофилы и простотой содержания в лабораторных условиях. Несмотря на широкое использование дрозофилы, размер яиц редко изучается в исследованиях эволюционной и популяционной биологии, отчасти из-за низкой производительности ручного измерения размера яиц.

Традиционно размер яиц измеряли при просмотре под микроскопом или стереоскопом2,7,8,9,10. Альтернативно яйца фотографируют под микроскопом и вручную измеряют их размеры по изображениям3,4,11,12. Недавно было разработано несколько инструментов анализа изображений для автоматического расчета размера объектов13,14. Методы, основанные на ручных измерениях, отнимают много времени и утомительны, поскольку яйца необходимо вручную перенести и расположить в правильной ориентации, прежде чем делать снимки. Измерение размера яйца вручную также подвержено ошибкам из-за предвзятости экспериментатора. Конвейеры анализа изображений также требуют, чтобы образцы были сфотографированы на фоне определенного цвета и яркости13. Более того, ручные измерения или инструменты анализа изображений обычно не могут гарантировать получение жизнеспособных яиц, которые можно использовать для последующего анализа.

Проточная цитометрия позволяет быстро и точно сортировать и измерять размеры мелких объектов размером до 200 мкм. Но средний размер яиц подгруппы видов D. melanogaster колеблется от 400 до 600 мкм4,5,8,9,10, что слишком велико для обработки традиционными проточными цитометрами. Появление проточной цитометрии крупных частиц (LPFC) сделало возможным измерение живых объектов размером до 1500 мкм. Системы LPFC работают с более медленной скоростью потока и более низким давлением по сравнению с традиционными проточными цитометрами, чтобы избежать разрушительных сил сдвига. LPFC использовался для анализа флуоресцентно-меченных или трансгенных организмов, например, яиц нематод15, D. melanogaster16 и Anopheles gambiae17, а также личинок кораллов18. Объекты с нефлуоресцентной меткой также можно анализировать и сортировать на LPFC исключительно по их размеру. Однако в отсутствие флуоресцентной маркировки форма объектов влияет на точность оценки размера. Например, форма семян арабидопсиса — вытянутая сфероидная или кардиоидная19, поэтому измерение размера семян арабидопсиса практически не зависит от ориентации семян20. Однако для объектов со сплюснутой или вытянутой эллипсоидной формой, таких как яйца дрозофилы, предполагаемый размер может варьироваться в зависимости от ориентации объектов в проточном цитометре. Размер объекта правильно измеряется только тогда, когда объекты ориентированы вдоль своей оси, но может быть занижен, если объекты не проходят вдоль своей оси (рис. 1А,Б).